En 1888, Hellriegel y Wilfarth demostraron sin lugar a dudas, el origen bacteriano de la fijación de nitrógeno en los nódulos de las raices de las leguminosas, nódulos que ya fueron descritos por Malpighi en 1679, y de donde Beyerinck aisló la primera bacteria fijadora en el mismo 1888 e inoculó con ella plantas que desarrollaban las mismas tumoraciones. Estos experimentos no presentaban los problemas que algunos autores encontraban cuando se inoculaba con extractos de nódulos que, según ellos, aportaban a las plantas el nitrógeno que Hellriegel y Wilfarth creían procedía del aire. Tuvieron que pasar, bastantes años hasta que quedara definitivamente zanjada la cuestión con la aceptación absoluta de la existencia de la fijación biológica de nitrógeno Una vez establecida una explicación racional, se desarrolló una intensa investigación sobre el tema. Así, pronto se reconoció el gran interés agronómico de la adición de bacterias a plantas leguminosas, la llamada inoculación o fertilización microbiana. Se hizo necesario el desarrollo de métodos para el cultivo de los organismos, para retener su viabilidad y seleccionar las cepas más capaces de fijar. De ahí a la preparación industrial de inóculos, una vez establecidos los diferentes grupos de inoculación cruzada como consecuencia de la especificidad microbio- planta, había un paso. Se dieron normas de seguridad y calidad de los inóculos llegandose hasta nuestros dias donde hay que considerar en ellos, no sólo las propiedades simbióticas de las bacterias, sino también su posible impacto sobre la microbiota del suelo, considerando, además, la posibilidad de transferencia genética entre microorganismos, especialmente, si se utilizan estirpes genéticamente manipuladas. El conocimiento de la existencia de bacterias fijadoras libres, en ausencia de planta, tuvo que esperar a que Beyerinjk describiera en 1901 la bacteria aerobia Azotobacter chroococcum y dos años más tarde el anaerobio Clostridium pasteurianum. Desde entonces la lista de fijadores ha ido creciendo y todavía sigue abierta, reducida siempre, por supuesto, a procariotas, siendo una de las últimas aportaciones científicas en este campo la presencia de la actividad fijadora en Arqueobacterias, hecho de gran interés por lo que supone desde el punto de vista evolutivo y de versatilidad del proceso, dadas las especiales características de estos microorganismos capaces de crecer en ambientes extremos. Los estudios sobre la bioquímica de la fijación comenzaron con Meyerhof y Burk en 1928 utilizando A. chroococcum como organismo de ensayo y ya en 1940 existían suficientes conocimientos para que Wilson publicara el libro titulado "Bioquímica de la Fijación Biológica de Nitrógeno". Por este mismo año se comenzó a utilizar el 15N para conocer más profundamente la fijación y realizar experimentos cuantitativos precisos, así como para confirmar de una vez, por Zelitch en 1952, que el amonio era el primer compuesto estable de la fijación, aunque hubo que esperar a 1965 para que Mortenson demostrara que la nitrogenasa, la enzima implicada en el proceso, estaba formada por dos componentes inactivos por separado. Por esta época se introduce la técnica de reducción del acetileno a etileno para determinar la actividad nitrogenasa y algo más tarde, las técnicas propias de la biología molecular que contribuyen al gran avance experimentado en los conocimientos adquiridos sobre este proceso biológico.