One frequently hears that everything is known about nitrogen fixation from the application point of view. It is said that since it was discovered in 1888, this subject has sufficiently been studied to take advantage of its potential in agriculture. It could be the truth in the case of legumes and the use of selected inocula, but there are many other interesting aspects to be considered in view of new knowledge. We can then ask ¿is there a future for the research in nitrogen fixation? We can reply yes, and we must continue with its study based on the necessity of a) increasing food security due to the evolution of the population and the change of food habits; b) diminishing the use of nitrogen fertilizers due to their economic and environment cost; and c) maintaining natural ecosystems.
Taking into account this scenario a series of actions can be considered:

The optimal use of the current nitrogen fixing systems
The transfer of the nitrogen fixing ability to other organisms as plants
Development of new nitrogen fixing associations

No es infrecuente oir que, bajo el punto de vista aplicado, se conoce todo lo que interesa sobre la fijación biológica de nitrógeno (FBN). Se dice que desde su descubrimiento en 1888 ya se ha investigado lo suficiente para aprovechar en agricultura todo el potencial de este proceso microbiano. Lo que a primera vista pudiera ser cierto, si se considera que en el caso de las leguminosas todo consiste en aislar y seleccionar cepas para preparar los inóculos adecuados, existen todavía muchos aspectos desconocidos o mejorables que requieren su estudio además de la posible extensión del carácter fijador a otros sistemas. Podemos preguntarnos entonces, ¿tiene futuro la investigación en FBN y su aplicación? A esta pregunta se puede contestar afirmativamente basados en una serie de razones tales como, a) la necesidad de aumentar la producción de alimentos a causa del incremento de la población y el cambio en los hábitos alimenticios; b) la conveniencia de disminuir el uso de fertilizantes por su costo y la posible escasez de materia prima (gas y petróleo), la contaminación del medio que conlleva su uso y su baja eficiencia, y c) la presión por mantener los ecosistemas naturales.

Teniendo en cuenta este panorama es posible emprender una serie de acciones con el fin de aprovechar al máximo las posibilidades que brinda la FBN, muchas de ellas apoyadas en los conocimientos que ya se tienen y otras derivadas de las investigaciones en marcha.
Estas acciones se pueden concretar en cuatro bien diferenciadas:

1. Utilización óptima de los sistemas fijadores actuales

2. Transferencia de la capacidad fijadora a otros organismos

3. Desarrollo de nuevas asociaciones fijadoras

4. Utilización de los fijadores para la obtención de fertilizante nitrogenado

1. Utilización óptima de los sistemas fijadores actuales.

Con respecto a la primera de las acciones indicadas, como se puede apreciar en la Tabla 1, son muchos los microorganismos procariotas capaces de fijar el nitrógeno molecular. Se encuadran en muy variados grupos y reducen el N2 en diferentes situaciones, esto es, libres o en asociación más o menos íntima con plantas.

Tabla 1. Bacterias y sistemas fijadores de nitrógeno
-----------------------------------------------------------------------------
Bacterias fijadoras en vida libre
Anaerobias estrictas, facultativas, aerobias, fototrofas, arqueas

Asociaciones fijadoras
     Rizocenosis diazotróficas:
          Azotobacter, Beijerinckia, Bacillus.
           Azospirillum, Azoarcus, Herbaspirillum,
           Gluconacetobacter con gramíneas

     Simbiosis asociativas:
           Anabaena con Azolla
           Nostoc con musgos y hepáticas
           Calotrix con hongos (líquenes)

     Rizoendobiosis diazotróficas:
           Rhizobium (considerado en general) con leguminosas
           b-Rhizobium: Burkholderia, Ralstonia, Wolvachia
            y otras) con leguminosas
           Frankia con angiospermas no leguminosas

1.1. Fijadores libres.

Las bacterias fijadoras libres presentan pocas posibilidades de mejora. Su eficiencia es baja. En la Tabla 2 se puede ver la diferencia que existe entre fijadores libres y simbióticos respecto a la cantidad de N2 fijado por unidad de superficie y año. La dependencia energética del proceso es muy grande, como es de sobra sabido. Las bacterias aerobias tienen, además, que preservar la nitrogenasa y su actividad del oxígeno del medio y las anaerobias son de por sí poco eficientes. Como ejemplo, Azotobacter, prototipo de fijador aerobio, consume unos 100 g de glucosa por gramo de nitrógeno fijado frente a 6-12 g en el caso de la simbiosis mutualista Rhizobium-leguminosa.. Tendría que haber una buena cantidad de materia orgánica en el suelo, directamente utilizable por los fijadores libres y sin competencia con otros microorganismos, para llegar a los niveles exigidos para un buen abonado. Hay que tener en cuenta, además, que el nitrógeno así fijado no es directamente utilizable por las plantas, ha de ser previamente mineralizado en el ciclo biogeoquímico correspondiente (~olivares/ciencia/fijación/index.html). Esto hace inviable la utilización masiva rentable de los fijadores libres, a pesar de algunos intentos descritos en la bibliografía (azotobacterinas),

Tabla 2. Eficiencia agronómica relativa de algunos
                 sistemas fijadores de nitrógeno
-----------------------------------------------------------------
Organismo o sistema                   Kg N/ha/año
---------------------------------------------------------
              Alfalfa                                                  300
              Trébol                                                  250
              Altramuz                                              150
              Aliso (Alnus) (hojas                             100
              Cianobacterias                                   25-50
              Azotobacter                                           < 1
              Clostridium. pasteurianum                  < 0,5

1.2. Simbiosis Rhizobium-leguminosa

Visto lo que antecede, el sistema simbiótico es el más aprovechable y especialmente, la asociación Rhizobium-leguminosa, considerado Rhizobium en sentido general, esto es, bacterias pertenecientes a los géneros Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium, … que se establecen en simbiosis mutualista con leguminosas. En la Fig. 1 puede apreciarse que con la aplicación de la simple inoculación apenas se alcanzan las dos terceras partes del rendimiento potencial que se podría conseguir con la fertilización nitrogenada.

Los conocimientos actuales no dan para mucho más aunque podrían mejorarse algo con el buen manejo de algunas prácticas agrícolas, la manipulación de las bacterias y la eliminación de factores limitantes de distinta naturaleza.

1.2.1. Mejora de las prácticas agrícolas

Entre la mejora de las prácticas agrícolas puede señalarse una fertilización nitrogenada adecuada. El ahorro de energía es un denominador común en todos los seres vivos. Si existe en el suelo suficiente nitrógeno utilizable por la planta se inhibe el establecimiento de la simbiosis. No hay infección y nódulación y tampoco fijación en el caso de que se hubieran formado nódulos. Los mecanismos implicados en esta inhibición son variados y hasta cierto punto desconocidos. En la inhibición de la nodulación pueden estar implicadas distintas fitohormonas, entre ellas el etileno, y la fijación de nitrógeno puede caer por la disminución en el suministro de fotosintetizado a los nódulos y/o efectos inhibidores sobre la nitrogenasa de compuestos nitrogenados derivados de la reducción del nitrato. Pero si el nitrógeno se aplica justo en el momento de la floración/fructificación no tendrá un efecto perjudicial sobre la fijación porque en esa etapa la actividad nitrogenasa cae drásticamente como consecuencia de la falta de fotosintetizado que de las hojas es entonces derivado al llenado de los frutos. En la Tabla 3 se puede apreciar el efecto positivo de la aplicación de nitrógeno en floración sobre los rendimientos de un cultivo de habas en campo en dos anualidades climáticamente diferentes.
Otras opciones a señalar pueden ser la implementación de la rotación de cultivos y la intersiembra, prácticas en marcha en numerosos lugares con evidente éxito.

Tabla 3. Efecto de la inoculación con Rhizobium leguminosarum
bv. viciae y la aplicación de N en floración sobre el rendimiento de
      un cultivo de haba (Vicia faba var minor)
     -------------------------------------------------------------------------------------
         Tratamiento*                           Rendimiento (Tn/ha)
            N        R               1979-80    %                          1980-81     %
     -------------------------------------------------------------------------------------
             -         -                    1,96       100                            0,60       100
             -         +                   2,10       107                            0,65       125
             +        +                   2,46       125                             1,05      175
     -------------------------------------------------------------------------------------
* N = 40 Kg N (urea)/ha; R = Inoculación
(Tomado de Olivares et al. 1983. J. Agr. Sci. 100, 149-152)

   1.2.2. Limitaciones de la fijación simbiótica de nitrógeno

            El rendimiento potencial de la simbiosis Rhizobium-leguminosa se encuentra limitado por diferentes factores derivados del medio, del propio sistema biológico, de la metodología al uso y de ciertas implicaciones socio económicas.
            Las limitaciones impuestas por el medio tienen como orígen el suelo y el clima. La acidez, la presencia de metales pesados, bajas concentraciones de fósforo asimilable, el exceso de sal, la falta de agua o los altos niveles de metales pesados o nitrógeno combinado son los principales factores naturales del suelo a considerar. A estos hay que añadir los derivados de las prácticas agronómicas dirigidas a la eliminación de enfermedades, plagas o malas hierbas que utilizan agroquímicos, la mayor parte tóxicos para la microbiota del suelo.
            La planta y el microsimbionte presentan también sus limitaciones. Independientemente del handicap que supone la especificidad de la asociación simbiótica, que en algunos casos hace imprescindible la inoculación con especie/cepa de Rhizobium adecuada, hay variedades de leguminosas más o menos susceptibles a la infección, con diferente aptitud para nodular o establecer una simbiosis efectiva y eficiente. Las bacterias, por otro lado, varían en su infectividad, competitividad, y capacidad para fijar nitrógeno.
            La adecuada preparación y manejo de los inóculos es un factor a considerar. Es importante tener en cuenta la elección de la cepa idónea para el cultivo previsto, la obtención de la masa microbiana, la conservación del inóculo en buenas condiciones y la correcta aplicación en el campo. Relacionado con el uso de inoculantes es necesario señalar la falta generalizada de información por parte del agricultor sobre necesidad o utilidad de esta práctica, imprescindible si el cultivo es de nueva introducción en un suelo concreto, caso de la soja fuera de los países del lejano este, o cuando las características del suelo prevean una baja supervivencia de Rhizobium.
            Finalmente, no se debe olvidar la competencia con otros cultivos, lo que exige conseguir de las leguminosas su máximo rendimiento, así como estudiar la historia del suelo en el sentido de conocer las prácticas agrícolas aplicadas a los cultivos anteriores, especialmente en lo referente a la fertilización nitrogenada.

      1.2.3. Posibles acciones sobre Rhizobium para mejorar sus características simbióticas

            Especificidad, infectividad, competitividad, efectividad y eficiencia son las características que marcan una determinada cepa de Rhizobium. Aunque por selección se puede conseguir una con buena expresión general, existen hoy suficientes conocimientos para manejar estas características de tal forma que puedan alacanzarse mayores rendimientos de los cultivos. Sin embargo, el fruto del incremento de la infectividad o de la efectividad, esto es, la capacidad de producir nódulos o fijar nitrógeno, respectivamente, está limitado por la planta, no sólo por su grado de susceptibilidad a la infección, sino también por la dependencia energética de la fijación de la disponibilidad de fotosintetizado que llega a los nódulos desde las hojas y la mayor o menor facilidad del transporte del amonio incorporado.
            En cualquier caso, se han descrito sistemas para incrementar alguna de estas características por técnicas moleculares. En la Fig. 2 se muestran ejemplos de los que hay referencias en la bibliografía de actuaciones que se pueden realizar para incrementar la infectividad y competitividad de Rhizobium.

También se han realizado algunos intentos para obtener cepas más efectivas. En este sentido se ha incrementado la dosis génica de los genes estructurales de la nitrogenasa, genes nifHDK, o se han colocado bajo el control de promotores más fuertes. El mejor aprovechamiento de los recursos energéticos por la fijación es real en unos casos y potencialmente alcanzable en otros. En la Fig. 3 se exponen tres ejemplos de posibles actuaciones para mejorar la eficiencia el proceso. De ellos el caso de la hidrogenasa es el más estudiado a nivel molecular y práctico.

Al mismo tiempo, otras acciones a tener en cuenta van dirigidas a obtener cepas más resistentes a sequía, acidez, metales pesados, salinidad, fitofármacos, esto es, a los distintos factores que pueden afectar el establecimiento de una simbiosis óptima.

Actuaciones sobre otros fijadores

Hay una serie de fijadores que se establecen en asociación más o menos íntima con diversas plantas, especialmente gramíneas. Entre ellos se pueden citar las diferentes especies de Azospirillum, que reducen N2 en microaerobiosis, que se multiplican abundantemente en los espacios intercelulares del cortex radical donde lleva a cabo la fijación a expensas de los exudados allí presentes. El hecho palpable de que las plantas infectadas con estas bacterias manifestaran un mayor crecimiento en comparación con las no inoculadas, dio pie allá por los 70 con Johanna Döbereiner al frente, a un gran entusiasmo sobre la posibilidad de utilizar estos microorganismos como sustitutos de la fertilización nitrogenada de especies vegetales tan importantes como el maíz o la caña de azúcar. Posteriormente, muchos autores, entre ellos Yakov Okon, han atribuido el efecto de Azospirillum, y otras bacterias fijadoras, a la producción por estas bacterias de fitohormonas que aumentan el desarrollo del sistema radical permitiendo la exploración de mayor suelo y, por tanto, un mejor acceso a los nutrientes. Esta conclusión era de esperar, pues, a diferencia de Rhizobium que está evolutivamente preparado para exportar el N2 fijado a la célula radical hospedadora, Azospirillum no actúa así y el N2 que fija es asimilado para su propio crecimiento y multiplicación. Sin embargo, en la naturaleza se da un hecho curioso que podría tomarse como modelo para una actuación interesante con estas bacterias fijadoras. Anabaena azollae, una cianobacteria que se asocia simbióticamente con Azolla, manifiesta una actividad glutamina sintetasa (GS) alta cuando fija en vida libre. La GS, como se sabe, es la enzima clave para la incorporación del amonio procedente de la reducción del N2. Cuando esta cianobacteria entra en simbiosis con el helecho la actividad GS aparece reducida unas diez veces lo que posibilita la exportación del amonio producido y su utilización por Azolla. La manipulación adecuada de Azospirillum para que actuara en este sentido podría llevar al aprovechamiento por la plantas del N2 fijado en sus raíces. La reciente secuenciación del genoma de un cepa endofítica de Azoarcus facilitará sin duda la potencialidad biotecnológica de este tipo de bacterias.

1.4. Problemas relacionados con la inoculación

            Cualquiera que sea el microorganismo que se vaya a dispersar requiere de la adopción de las medidas necesarias para evitar un impacto negativo sobre el ambiente ya que se puede alterar la biodiversidad del medio o la difusión de genes no deseables. Este problema es inherente a la utilización de los inóculos microbianos dirigidos a la biofertilización, biocontrol y biorremediación. En el caso de Rhizobium la preparación y el uso de los inoculantes han alcanzado un nivel suficiente para la obtención de buenos rendimientos de los cultivos de leguminosas y de poder aprovechar las mejoras que se vayan introduciendo en las cepas microbianas.
            Hay dos sistemas posibles para la obtención de inóculos seguros. Uno de ellos es la utilización de genes suicidas de tal forma que la bacteria introducida desaparezca una vez cumplida su misión. Es un método que ha mostrado su utilidad cuando se trata de biorremediadores que se mantienen activos mientras hay sustrato a degradar, pero de difícil aplicación en Rhizobium por su doble estado de vida, libre en el suelo o en simbiosis dentro de las células de las raíces de las plantas infectadas.
            Una alternativa a seguir para minimizar los posibles daños colaterales de su presencia en el medio es evitar la transferencia genética de la cepa inoculada a las propias del suelo. La transferencia genética horizontal es un hecho demostrado y generalizado en Rhizobium y en muchas especies bacterianas. Una característica común de Rhizobium es que los genes implicados en la simbiosis se localizan en replicones independientes conocidos como plásmidos simbióticos (pSym) o en “islas simbióticas” dentro del cromosoma. Al margen de estos elementos simbióticos estas bacterias pueden llevar plásmidos adicionales, llamados no simbióticos o crípticos, dispensables y de función desconocida la mayoría de las veces.
            La capacidad de Rhizobium para nodular leguminosas le provee de un nicho ecológico ventajoso por lo que parece razonable pensar que la adquisición de la información genética necesaria para la expresión de esa característica es un hecho importante en la evolución de estas bacterias del suelo. Hay clara evidencia de la transferencia de los plásmidos o islas simbióticas en la rizosfera de las leguminosas y en el suelo, sin embargo, la transferencia de la mayoría de estos elementos en el laboratorio ocurre a frecuencias tan bajas que dificultan la explicación de lo que ocurre en condiciones naturales, aunque hay unos pocos casos particulares, como el del plásmido pRL1J1 de R. leguminosarum, que muestra una frecuencia de conjugación alta en medios de cultivo que está regulada por quorum sensing como en el caso de otros plásmidos. La baja frecuencia de transferencia de la mayoría de los plásmidos e islas simbióticas en el laboratorio sugiere quesu movilidad está controlada estrictamente o que estos elementos han perdido la capacidad para moverse. Esta segunda posibilidad no parece darse ya que de su estudio genómico puede deducirse que se encuentran en ellos los genes potencialmente implicados en transferencia.   La Fig. 4 muestra la distribución del genoma de la cepa CE3 de R. etli. Contiene 6 plásmidos de los cuales el pRetCFN42d es el simbiótico y puede transferirse cuando se cointegra con al pRetCFN42a.

Precisamente, el análisis del plásmido simbiótico pRetCFN42d ha revelado la existencia de un gen, rctA, que es un elemento esencial en la regulación de la transferencia genética. Su producto, un factor trancripcional, no presenta secuencias conservadas con otras proteínas de función conocida. Como se puede apreciar en el esquema de la región del oriT que se presenta en la Fig. 5, rctA parece estar autorregulado positivamente, pero su expresión está reducida por la sobreexpresión de otro gen, rctB, identificado previamente como posible activador de la transferencia del pSym de R. etli. En condiciones de laboratorio la transferencia se reduce por la falta de una señal ambiental, todavía desconocida, que activaría la expresión del gen rctB. Un mecanismo similar puede aplicarse a plásmidos de otras Rhizobiales como el pSymA, de 1,35 Mb, de Sinorhizobium melilot y es posible que sea bastante general.

El conocimiento de esta regulación puede permitir actuar del modo adecuado para minimizar la dispersión de genes a partir de las cepas introducidas como inoculantes y hacerlos así más seguros.

2. Transferencia de la capacidad fijadora a otros organismos

La capacidad de fijar nitrógeno es exclusiva de procariotas aunque está muy extendida entre los diferentes grupos bacterianos. Parece ser que esa presencia tan amplia se debe a la transferencia horizontal que ha estado funcionando a lo largo del tiempo, pero a pesar de ser este carácter aparentemente enriquecedor para las bacterias hay muchas que no lo poseen, bien porque no hayan recibido la información genética necesaria, lo que parece raro, o bien, y es lo más probable, que ni el ambiente donde viven ni sus características propias hacen conveniente o imprescindible un proceso tan consumidor de energía como la fijación.
Entre las distintas posibilidades de actuación a contemplar, la transferencia del carácter fijador a bacterias de por sí no fijadoras no tiene mucho sentido, pues al nuevo organismo se le puede aplicar lo que se ha indicado antes al hablar de la mejora de los fijadores libres. El salto de este carácter a los eucariotas no se ha producido por lo que se puede pensar en los hongos formadores de micorrizas, los hongos superiores (setas y trufas) o las plantas como posibles aceptores.

            Para que se lleve a cabo la fijación es necesario que el organismo receptor pueda proporcionar los requerimientos que exige el buen funcionamiento del proceso a partir de la información genética que se transfiere, entre ellos, una fuente adecuada de energía, poder reductor y esqueleto carbonado para la incorporación del amonio resultante de la fijación además de la ausencia de oxígeno o protección contra él.

            La especial distribución de los genes (nif) implicados en la fijación en algunos organismos, como Klebsiella pneumoniae, no sólo ha posibilitado el estudio genético a fondo del proceso, sino que también ha permitido transferir fácilmente esta característica a otras bacterias inicialmente no fijadoras. Dados los conocimientos que se tienen hoy día sobre la obtención de plantas transgénicas, no así de hongos, el traspaso de los genes nif no debería ser muy difícil aunque el tamaño del ADN a transferir puede ser excesivo por lo que habría que desarrollar la técnica adecuada. Otra cosa es la expresión de los distintos operones que habría que colocarlos bajo el control de promotores reconocidos por el hospedador, dificultad también salvable. En este sentido se ha preconizado que el lugar ideal de inserción podría ser el ADN cloroplastídico, de origen microbiano y situado en un lugar donde hay provisión de energía y poder reductor suficientes, dos de los requerimientos esenciales. El amonio producido podría ser incorporado como el procedente de la reducción del nitrato. Sin embargo, hay otro problema adicional e importante. Aunque el sistema se manipule en la transferencia para liberarlo de la regulación por nitrógeno combinado y oxígeno, se ha venido a escoger el lugar de la planta donde se libera este elemento para el que la enzima nitrogenasa es muy lábil, se inactiva fácilmente de forma irreversible. Pero se han descrito propuestas para solventar este obstáculo. Algunas cianobacterias, como Gloeothece o Synechococcus, en lugar de formar heterocistos se protegen del oxígeno fijando sólo en la oscuridad y otras, Streptomyces thermoautrophicus, por ejemplo, poseen una nitrogenasa oxígeno tolerante. Estas son dos posibilidades que se podrían aplicar para conseguir plantas fijadoras, aunque la fijación generaría un pool adicional de especies reactivas de oxígeno que habría que eliminar, incrementando el suministro de reductores y electrones o aumentando las actividades antioxidantes. Este panorama que se presenta, si bien parece atractivo, está lleno de dificultades no fáciles de solventar lo que hace poco probable o incierta la posibilidad de obtener plantas capaces de utilizar el N2 por sí mismas.

Desarrollo de nuevas asociaciones fijadoras

         Otra cosa es conseguir plantas y bacterias que puedan establecer simbiosis fijadoras. El bagaje de conocimientos a todos los niveles que se tiene de Rhizobium le hace el microsimbionte de elección para poder infectar eficazmente especies vegetales distintas a leguminosas frente a otros microorganismos descritos con igual capacidad, como Burkholderia, Wautersia o Frankia.
         Para el desarrollo de nuevas asociaciones fijadoras Rhizobium-no leguminosa, como trigo, arroz o maíz, es necesario tener en cuenta aspectos importantes que son propios de cada uno de los organismos implicados o de la interacción, como pueden ser las señales de intercambio entre los dos miembros de la asociación, el control de la respuesta defensiva del hospedador a la infección y la adaptación de la planta para poder nodular y fijar.

3.1 Señales

Entre planta y bacteria se establece un intercambio de señales bastante bien conocido a nivel molecular. En la Tabla 4 se exponen las asociaciones específicas entre Rhizobium y leguminosas y la Fig. 6 presenta los determinantes genéticos de la interacción: los flavonoides exudados por las raíces, los factores Nod sintetizados por la bacteria en respuesta al flavonoide específico y los correspondientes receptores de las raíz.

Conocidos estos determinantes genéticos y la interacción entre ellos, para extender la capacidad de fijar a otros sistemas es necesario que la bacteria elegida reconozca los exudados de su posible hospedador que puedan inducir la síntesis de un Factor Nod apto para unirse específicamente al receptor o receptores de la planta y así poder poner en marcha la cascada necesaria para llevar la infección a buen término: la deformación de los pelos radicales y su curvatura, la invasión de las células del cortex a través del canal de infección y la división de las células corticales para formar el primordio nodular. Para ello hay que o manipular la planta para que exude un flavonoide en concreto o manipular la bacteria para que responda al nuevo flavonoide sintetizando el Factor nod para el que la planta también debe tener el receptor adecuado para su reconocimiento y así poderse desencadenar el proceso.

3.2. Control de la respuesta defensiva

Un segundo aspecto a considerar en el desarrollo de nuevas asociaciones fijadoras es el control de la respuesta defensiva (RD) que se dispara en las plantas cuando se encuentran frente a un organismo extraño. La interacción puede ser neutra, compatible o incompatible. En el primer caso hay una RD rápida y débil, sin crecimiento microbiano ni lesión. En la interacción compatible hay una RD retrasada, crecimiento microbiano activo y lesión. En la incompatible, que surge cuando el producto de los genes avr (de avirulencia) que lleva el patógeno es reconocido por el de los genes R de la planta, hay una RD rápida y fuerte con un pulso oxidativo importante, una reacción de hipersensibilidad localizada, resistencia sistémica adquirida (SAR) y ausencia de lesión. ¿En cual de estos tres tipo puede encuadrarse la interacción Rhizobium-leguminosa? Es difícil contestar a esta pregunta. En principio parecería que la planta podría reconocer a la bacteria como no patógena y reaccionar frente a ella en una interacción neutra. Sin embargo, la presencia en Rhizobium de determinantes genéticos propios de patógenos, por un lado, y la detección en la planta de reacciones ligadas a RD, por otro, han llevado a creer en la existencia de una interacción planta-patógeno regulada, lo que permite la infección controlada de las células radicales para formar los nódulos.
En la Tabla 5 se relacionan algunos componentes de bacterias patógenas de plantas y animales que se han identificado en Rhizobium. Como se puede ver hay bastantes elementos comunes, no sólo con bacterias patógenas de plantas sino también de animales, particularmente con aquellas especies que pasan por un estado intracelular, como Brucella.

La Fig. 7 muestra las moléculas claves de la planta presentes en respuesta defensiva frente a patógenos, que también, con mayor o menor intensidad, se han detectado en la interacción Rhizobium-leguminosa. Desde que la bacteria entra en contacto con la raíz hasta que se transforma en bacteroide activo Rhizobium está sujeto a una situación continua de rechazo que tiene que superar y, como se comentará más tarde, su control es fundamental para la buena marcha de la asociación en su camino hacia una nodulación efectiva.

Las plantas responden a la infección por patógenos con una reacción de hipersensibilidad (HR) en la que una de los primeros hechos que ocurren y se observan es una rápida producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). En la Fig. 8 se listan algunos de los hechos que se han descrito relacionados con la implicación de ROS en la simbiosis Rhizobium-leguminosa donde también parece inducirse una HR que puede ser parte del mecanismo de autorregulación de la nodulación. A modo de ejemplo se incluye en esta figura la gráfica correspondiente a los datos obtenidos sobre la acumulación de peróxido de hidrógeno en raíces de alfalfa en las primeras horas después de ser inoculadas con una cepa silvestre de S. meliloti o con un mutante nodC, esto es, incapaz de sintetizar Factor Nod.

El H2O2 se acumula cuando las plantas son inoculadas con la cepa mutante, mientras que la inoculación con la silvestre origina niveles similares a los del control sin inocular. Además de H2O2 también se acumula ácido salicílico (SA), como se muestra en la Fig. 9. Esta figura recoge asimismo datos relativos a la nodulación y puntos de infección de plantas transgénicas NahG de Medicago truncatula, que son incapaces de acumular SA. Estas transgénicas son más susceptibles a la infección y forman mayor número de nódulos. Los ejemplos presentados aquí, junto con el hecho de que la aplicación de SA exógeno inhibe la formación de nódulos, especialmente los indeterminados, permiten deducir la importancia del control de la RD en el proceso de infección de las raíces por Rhizobium.

            El etileno es otra de las moléculas clave en las interacciones patógeno-planta y Rhizobium-leguminosa. Se ha descrito su liberación en distintas etapas de la simbiosis, tales como formación del nódulo, madurez y senescencia. Impide la transducción de las señales desencadenadas por los Factores Nod, tales como los pulsos (spiking) de calcio, por lo que es un regulador negativo de la infección al bloquear el inicio y desarrollo de los canales de infección e inhibir la división de las células del cortex. Por otra parte, sin embargo, el etileno parece proporcionar información posicional al determinar el lugar de aparición de los nódulos en la raíz.
            Otras moléculas señales implicadas en la respuesta defensiva y en la simbiosis, en paralelo también con la patogénesis, son el óxido nítrico y el ácido jasmónico. NO y la actividad óxidonítrico sintasa se han detectado en nódulos cuyo número y la fijación de nitrógeno parecen estar afectados por esta especie reactiva de nitrógeno. Para el buen establecimiento de la simbiosis y su funcionamiento y, como ocurre con las ROS, el nivel de NO ha de ser controlado, y en este sentido la leghemoglobina pudiera estar implicada en su remoción.
            Como se puede ver en la Fig. 10, la actividad lipoxigenasa (LOX) se incrementa en la interacción incompatible S. meliloti-alfalfa. Se ha descrito, además, que la aplicación exógena de ácido jasmónico inhibe la nodulación. Este es un ejemplo más del paralelismo que se da entre patogénesis y simbiosis. Sin embargo, así como en la interacción patogénica una respuesta fuerte lleva a la planta a resistir la infección, en el caso de la simbiosis mutualista esta respuesta ha de encontrase en los niveles adecuados para, por un lado, permitir la infección y, por otro, que ésta se desarrolle en los términos convenientes.

Para llevar a cabo ese control se han descrito varios componentes bacterianos (Fig. 11), la mayoría de ellos comunes con patógenos, y algunos, como el sistema de transporte tipo tres (TTSS), de acción ambivalente pues en unos casos interviene en la inducción de la RD y en otros en su control.

A la vista de todo lo indicado arriba se puede deducir que Rhizobium posee las mismas armas que los patógenos, que las usa de una forma controlada y que por ello la planta responde de una manera suave y adaptada a la función que corresponde. En el esquema general (Fig. 12) de un escenario global para la interacción planta-organismos patógenos se puede incluir a Rhizobium con pleno derecho entre los distintos participantes.

Es posible concluir también que el Factor nod juega un papel importante en este control ya que, como se puede ver en las Figs. 8 y 9, las raíces de las plantas de alfalfa inoculadas con cepas de S. meliloti incapaces de sintetizar este factor (por, ejemplo, un mutante nodC-) acumulan más SA y H2O2 que las inoculadas con la cepa silvestre, que en consonancia con esto, muestra también unos niveles más altos de actividades enzimáticas antioxidantes como catalasa, ascorbato peroxidasa y superóxido dismutasa. Esta conclusión se ha confirmado cuando se han puesto las raíces de alfalfa en contacto con Factor nod purificado de S. meliloti en lugar de la bacteria pues hay inhibición de la liberación de H2O2 e incluso represión del pulso oxidativo que aparece en respuesta a elicitores de patógenos.
Por tanto, a la hora de intentar establecer una asociación entre Rhizobium y una planta no leguminosa habría en principio que actuar en dos direcciones: modificar la planta en el sentido de que exudara el flavonoide capaz de inducir la síntesis del Factor nod correspondiente a la cepa bacteriana en cuestión, o manipular la bacteria para que reconociera otros flavonoides inicialmente neutros para ella. Independientemente de esto, hay que adaptar la planta para responder a tal Factor nod de la forma adecuada y ello requiere todavía de una intensa investigación, a pesar de los conocimientos actuales acumulados. En cualquier caso parece que Rhizobium ha evolucionado a lo largo del tiempo de patógeno a beneficioso porque, como se expone en el Cuadro 1, hay una serie de hechos que parecen confirmar esta hipótesis

3.3. Adaptación de la planta

Son tantos los genes de la planta implicados en el proceso que va desde el reconocimiento de la bacteria hasta la formación de un nódulo fijador, que hacen este estudio bien complejo y dificulta llegar a resultados aplicables de manera rápida.
Se han obtenido numerosos mutantes deficientes en nodulación y/o fijación, principalmente de M. truncatula y Lotus japonicus. El análisis de dichos mutantes ha permitido conocer la implicación de una serie de genes en el proceso de reconocimiento, modificación de los pelos radicales, formación y progreso del canal de infección y organogénesis del nódulo. Algunos de los productos de estos genes ya eran conocidos y se les dio el nombre de nodulinas, o proteínas que aparecían en las raíces inoculadas o en los nódulos en formación o ya funcionales. La mayoría de los genes encontrados están presentes en no leguminosas y, de hecho, muchos han sido bien estudiados en Arabidopsis y otras especies vegetales. Así se ha visto que la nodulina ENOD40 afecta en tabaco la elongación de ciertas células por alteración de la cinética de la biosíntesis de etileno. También como ejemplo se presentan en la Fig. 13 algunos genes que son reguladores negativos de respuesta de defensa de la planta y que actúan en diferentes etapas de la interacción S. meliloti-M. truncatula. Su alteración provoca distintas deficiencias en el proceso de infección. Así, algunos, como NIP, causan alteraciones en la raíz similares a las que ocurren cuando se inocula con cepas de Rhizobium incapaces de producir EPS o LPS o sintetizan productos alterados. Estos genes parecen ser homólogos a AtERF4 y AtERF7 de Arabidopsis y NRR (negative regulator of disease resistance) de arroz. Su alteración produce una exacerbación de la respuesta defensiva y por ello, en el caso de las leguminosas el aborto del proceso de infección.

Otros mutantes relacionados con la respuesta defensiva y que se manifiesta en la autorregulación de la nodulación son SKL (sickle), SUNN (super numeric nodules), RDN (root determined nodules), en M. truncatula; SYM29, en Pisum sativum; HAR1 (Hypernodulation Aberrant Root), ASTRAY (Agravitropic lateral roots), LV (Klavier), en L. Japonicus; y GmNARK (Gm NoduleAutoregulation Receptor Kinase), en Glycine max. SUNN, SYM29, HAR1 y GmNARK son genes que codifican un receptor quinasa rico en repeticiones de leucina que es similar a AtCLAVATA1. Regulan negativamente el desarrollo de nódulos y raíces a través de una comunicación órgano-órgano. Paralelamente se ha descrito también que SUNN afecta la intensidad de la micorrización.
En la Fig. 14 se presenta un esquema, basado en Geurts et al. (Curr. Opin. Plant Biol. 8, 346-352 (2005)), de los genes conocidos implicados en nodulación y micorrización. Como se puede apreciar, ambas asociaciones tienen bastantes puntos en común. La dificultad que presentan los hongos formadores de micorrizas para crecer, en ausencia de hospedador ha retardado considerablemente el estudio de esta asociación en comparación con la simbiosis Rhizobium-leguminosa. Sin embargo, ya hay bastantes datos acumulados para conocer el paralelismo de estas dos asociaciones y establecer, incluso, la hipótesis de su relación evolutiva, aunque en el intercambio de señales, hoy por hoy, se desconoce la naturaleza del Factor Myc y de su receptor. Es posible que para la nodulación Rhizobium haya aprovechado el camino abierto en las plantas por los hongos micorrícicos hace más de 400 millones de años.

Como se puede ver en esta figura, la transducción de la señal percibida por la planta es bastante compleja con una gran cantidad de genes implicados en los múltiples pasos del proceso. Independientemente de los que se pueden reconocer como implicados directamente en la organogénesis del nódulo desde el reconocimiento de la señal, hay otros muchos relacionados con funciones colaterales tan importantes como la propia fijación o el aprovechamiento del amonio producido. Tal es el caso de los que codifican la leghemoglobina, permiten la asimilación del amonio producido y liberado del bacteroide al citosol de la célula hospedadora o el transporte del nitrógeno organizado.
La Fig. 14 no es una foto fija. Continuamente se están encontrando nuevos genes implicados en el proceso. Últimamente se han descrito algunos, como MtRR1, Mtrr4, LHK1 (no incluidos en la figura), implicados en la señalización de citoquininas, hormonas relacionadas con la formación de ramas y raíces laterales, y que en presencia del Factor nod determina la organogénesis del nódulo.
La mayoría de los genes relacionados de alguna manera con el proceso de infección, se encuentran en todas las plantas. El que unas puedan nodular y otras no, aparte del reconocimiento mutuo, parece ser un problema de regulación. Con los conocimientos que van acumulándose y con la tecnología adecuada no será difícil conseguir que especies vegetales fuera de las leguminosas, como los cereales, puedan hacerse independientes de la fertilización nitrogenada con el ahorro económico y de costo ambiental que su aplicación lleva consigo.

4. Utilización de los fijadores para la obtención de fertilizante nitrogenado

En esta acción caben dos alternativas: a) la obtención de biomasa, o b) la desregulación de la fijación de
nitrógeno en las bacterias libres, tales como las cianobacterias, para que exporten al medio el amonio producido. En el primer caso pueden utilizarse especies muy bien estudiadas que suelen cultivarse con otros propósitos, como la Scytonema oscellatum. La masa obtenida se incorpora al suelo como cualquier abono orgánico.
En la segunda alternativa, la exportación al medio de cultivo del nitrógeno fijado puede conseguirse, en teoría, con la adición al medio de un análogo competitivo de la glutamina, como la metionina sulfoximina (MSX), que impide la asimilación del amonio resultante de la reducción, o con la adecuada desregulación genética que lleve al mismo fin. La naturaleza muestra un ejemplo de este segundo caso. Anabaena azollae manifiesta una actividad glutamina sintetasa, que es la enzima clave para la asimilación del amonio, alta en vida libre y reducida diez veces cuando se encuentra en simbiosis con su hospedador, Azolla, lo que permite la transferencia a este helecho del nitrógeno fijado. Conviene no olvidar que la aplicación al suelo del amonio producido por estas vías presenta los mismos inconvenientes que el obtenido sintéticamente, sólo tendría la ventaja del ahorro de recursos energéticos no renovables consumidos en su obtención.

Conclusiones. Como se puede deducir de lo escrito arriba, la investigación en FBN tiene todavía mucho campo por delante, especialmente con la vista puesta en la sostenibilidad del planeta. Aunque mucho de lo expuesto pueda sonar a ciencia ficción hay ya una gran base de realidad que permite augurar la llegada a resultados positivos en un futuro no muy lejano, particularmente, y es una visión personal, en la posibilidad de poder contar con plantas fuera de las leguminosas, tan importantes en alimentación animal y humana, como puedan ser el trigo, el maíz o el arroz, capaces de utilizar el nitrógeno del aire en asociación con bacterias. Hay, sin embargo, un pequeño inconveniente y es que la fijación de nitrógeno es más costosa para la planta que la utilización del nitrato. El costo teórico es de 3,37 g C/g N para la primera frente a 0,9-2,4 para el nitrato. Esto determina que las plantas fijadoras per se o en simbiosis serían ligeramente menos productivas que las fertilizadas normalmente pero su cultivo tendría, en cambio, la ventaja de requerir menos inversión y de ser más respetuoso con el ambiente. Otro problema adicional sería la falta de concienciación social hacia los transgénicos, problema que se resolvería con una adecuada información.